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散发神经鞘瘤22号染色体杂合子丢失发生的研究

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更新时间:2012年08月15日 点击:
软件版本:国产软件
软件大小:0KB
软件授权:免费版
软件语言:简体中文
开发商家:林亦海
应用平台:Win9x/NT/2000/XP
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软件介绍

  【摘要】目的 探讨散发神经鞘瘤病人22号染色体 (CHR22) 杂合子丢失 (LOH) 情况及其与肿瘤增殖的关系。 方法 选取4个与NF2基因密切相关的多态性微卫星标记物,应用PCR方法研究54例神经鞘瘤的LOH情况。采用Ki-67和增殖细胞核抗原 (PCNA) 评估增殖指数。 结果 23例 (42.6%) CHR22发生LOH,听神经鞘瘤发生率显著性高于脊神经鞘瘤 (χ2 = 5.14P <0.05)。发生LOH者增殖指数明显高于无LOH者 (Pki-67 = 0.007 9PPCNA = 0.002 1)。 结论 在散发神经鞘瘤中,CHR22 LOH是常发事件;听神经瘤与脊神经鞘瘤LOH发生率有显著性差异,CHR22 LOH与神经鞘瘤的增殖活动性有关。

  【关键词】 神经鞘瘤 杂合子丢失 染色体 人 22

        Abstract: Objective To explore the loss of heterozygosity (LOH) on chromosome 22 (CHR22) in patients with sporadic schwannoma and the correlation with tumor proliferation. 

Methods Four highly polymorphic microsatellite DNA markers closely related to NF2 gene were used to analyze the frequency of LOH in 54 schwannomas by polymerase chain reaction. 

The proliferation index was evaluated by Ki-67 and proliferative cell nuclear antigen (PCNA). Results Twenty-three (42.6%) schwannomas showed LOH. The frequency of LOH in vestibular schwannoma was significantly higher than that in spinal schwannoma ( χ2 = 5.14P < 0.05). The proliferation index of schwannoma with LOH was significantly higher than that without LOH (Pki-67 = 0.007 9, PPCNA = 0.002 1). Conclusion LOH on chromosome 22 is a frequent event in the tumorigenesis of sporadic schwannoma. The frequency of LOH in vestibular 

schwannoma is significantly different from that in spinal schwannoma. And there is a correlation between LOH on chromosome 22 and proliferative activity in schwannoma.

   Key words: neurilemmoma; loss of heterozygosity; chromosomes, human, pair 22

  NF2基因是神经鞘瘤的肿瘤抑制基因[1],位于22号染色体 (CHR22) 长臂122亚带。分析神经鞘瘤CHR22上的杂合子丢失有助于阐明肿瘤分子发病机制。本研究检测了54例神经鞘瘤CHR22杂合子的丢失情况,发现听神经瘤和脊神经鞘瘤中杂合子丢失 (LOH) 发生率不同,且其发生与肿瘤增殖之间存在相关性,现报告如下。

  材料与方法

  1.1 标本来源 男22例,女32;年龄2077岁,平均47.3岁。均排除家族遗传倾向。36例为散发听神经瘤,其中复发性肿瘤2例,囊性神经鞘瘤3;18例为脊髓背侧根部神经鞘瘤,其中复发性肿瘤2例。获取肿瘤标本后即刻置入液氮,保存于-70℃冰箱中。

  1.2 微卫星标记 提取人血和肿瘤组织DNA。选择4个与NF2基因密切相关的微卫星多态标记物 (D22S264D22S268D22S280CRYB220),顺序为cen-D22S264-CRYB2-D22S268-D22S280-telPCR反应扩增引物同Lee[2]报道。

  1.3 PCR和电泳条件 反应体系包括基因组DNA 100 ng,氯化镁1.5 mmol/LdNTP 200 μmol/LTaq DNA聚合酶2 U,引物各1 μmol/L,加30 μl矿物油覆盖反应液。PCR循环条件:94℃变性4 min1个循环;94℃ 30 s52℃ 30 s72℃ 1 min30个循环;最后72℃延伸4 min。然后将PCR扩增产物加入6%变性聚丙烯酰胺凝胶 (7 mol/L尿素中电泳,凝胶经固定、染色、显色至清晰后,应用凝胶成像系统进行分析。

  1.4 Ki-67和增殖细胞核抗原 (PCNA) 免疫组织化学染色 具体过程详见相关文献[2-4]。阳性细胞为细胞核全部或部分呈棕黄色。Ki-67PCNA增殖指数:计算440倍视野 (1 000个细胞出现Ki-67PCNA阳性细胞数,用百分率表示。

  1.5 统计学分析 听神经瘤和脊神经鞘瘤之间及4个标记物之间LOH频率采用χ2检验。LOH病人和无LOH病人间增殖指数的差异采用Wilcoxon两样本比较法检验,以P <0.05为差异具有统计学意义。

   结 果

 

  2.1 LOH情况 (1) 本组发生LOH 23例 (42.6%),其中D22S268 12例,D22S280 10例,D22S264 12例,CRYB2 4;听神经瘤16例 (44.4%),脊神经鞘瘤7例 (38.9%)。两者发生率差异具有统计学意义 (χ2 = 5.14P <0.05)

  36例听神经瘤中,D22S268缺失11例,发生率高于CRYB2缺失;2例复发者同时发生4个微卫星标记物缺失;3例囊性肿瘤均发生LOH18例脊神经鞘瘤中,2例同时发生2个微卫星标记物缺失,其中1例为复发者。

  2.2 LOH和肿瘤细胞增殖 (1) 54例神经鞘瘤中,LOH病人增殖指数 (Ki-67PCNA) 显著性高于无LOH者,差异有统计学意义 (P <0.05)

   讨 论

 

  3.1 LOH情况 微卫星包含多种简单重复序列,常为 (CA)n和 (GT)n,以 (CA)n最常见。抑瘤基因等位基因缺失,往往伴随该基因附近区域DNA多态标记的缺失。因此,选取目前发现的与NF2基因密切相关的多态性微卫星标记,可发现肿瘤组织的LOH。近年虽出现了比较基因组杂交技术[5],但微卫星标记的高效性使其仍成为广泛使用的有效技术。

  本组44.4%听神经瘤发生CHR22 LOH,发生率与文献报道类似 (22%80%)[36]。本研究所使用的引物D22S268D22S280位于NF2的端粒端,D22S264CRYB2位于着丝粒,其中D22S268最靠近NF211例听神经瘤发生D22S268缺失,高于其他标记物,提示D22S268可能是发现听神经瘤LOH的一个特效标记物。

  本组38.9%脊神经鞘瘤发生CHR22 LOH,提示脊神经鞘瘤的发生也与CHR22有关。本研究中听神经瘤与脊神经鞘瘤LOH发生率不同,提示两类肿瘤发生机制并不相同,两者间的增殖指数 (Ki-67PCNA) 及超微结构也有差异[7]。本研究提示在不同的神经鞘瘤中存在不同的遗传学改变,神经鞘瘤生长部位及潜在发病机制是否与此有关尚不清楚。

  本组42.6%神经鞘瘤发生CHR22缺失,提示CHR22在肿瘤发生过程中具有重要作用。因为本研究采用混有非肿瘤DNA (如血管、神经、血液等细胞来源的标本进行PCR扩增,所以不能排除肿瘤DNA发生纯合子缺失,这就可以解释为何并非所有神经鞘瘤均发生LOHWarren[8]采用比较基因组杂交来研究神经鞘瘤LOH的发生,发现了位于其他染色体或22qNF2基因的中间缺失。文献报道等位基因的缺失可能并不位于CHR2222q NF2附近基因上[6],或肿瘤有隐匿性小缺失或点突变致NF2基因功能丧失。因此,需要更深入研究22q和整个CHR22

  3.2 LOH和肿瘤行为 了解肿瘤生长特征可指导临床治疗,尤其是肿瘤切除可能引起功能性面神经损伤时可决定是否全切肿瘤。增殖指数是一种常用的衡量肿瘤生长速度的组织学参数,常用Ki-67PCNA来评估神经鞘瘤的生长速度[9],但增殖调节机制仍不明。

  本组LOH和无LOH病人之间,两种增殖指数之间的差异均具有统计学意义,提示神经鞘瘤增殖可能与CHR22 LOH丢失相关,这与以往研究结果相似[10]。在听神经瘤中,LOH与无LOH病人间,Ki-67差异有统计学意义;在脊神经鞘瘤中,LOH与无LOH病人间,PCNA差异具有统计学意义。这可能与样本数不足或两类肿瘤的发生机制并不相同有关,有必要增加样本数进一步研究。Fraenzer[11]发现:NF2基因过度表达通过调节细胞表面生长因子降解的加速来抑制神经鞘瘤细胞生长。Saito[12]认为:血管内皮生长因子可能影响神经鞘瘤的生长潜能。因此,我们推断CHR22 LOHNF2基因失活增加了细胞表面生长因子的降解,这可能是影响散发神经鞘瘤增殖的一种重要方式。

  本研究中,4例复发性神经鞘瘤和3例囊性听神经瘤均发生LOH,因例数太少未行统计学分析,但仍提示:神经鞘瘤的临床行为,如复发、囊性改变和预后均可与NF2基因失活联系起来,但肿瘤遗传学的改变和临床行为的关系仍需深入研究。

  总之,CHR22 LOH在散发神经鞘瘤的发生中是常发事件。听神经瘤与脊神经鞘瘤的LOH发生率并不相同。肿瘤的行为与CHR22 LOH有关。NF2基因失活是影响散发神经鞘瘤增殖的重要因素。

  【参考文献】

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       [2] LEE D J, MASEYESVA B, WESTRA W, et al. Microsatellite analysis of recurrent vestibular schwannoma (acoustic neuroma) following stereotactic radiosurgery [J]. 

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       [11] FRAENZER J T, PAN H, MINIMO L Jr, et al. Overexpression of the NF2 gene inhibits schwannoma cell proliferation through promoting PDGFR degradation [J].

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